細(xì)胞復(fù)蘇、傳代與凍存操作流程

儀器與試劑

護(hù)目鏡、厚毛線手套等

操作流程

復(fù)蘇

1）將恒溫水浴鍋中的水預(yù)熱到 37℃；

2

）準(zhǔn)備一支 15ml 離心管，加入 5ml 含 10%FBS 的wan全培養(yǎng)基，放入 37℃水浴鍋中預(yù)熱；

3

）戴上護(hù)目鏡，厚毛線手套后，從液氮罐中取出要復(fù)蘇的細(xì)胞，盡快轉(zhuǎn)入 37℃恒溫水浴鍋中復(fù)溫晃動(dòng)凍存管以提高復(fù)溫速率；

4

）將融化了的凍存管中的細(xì)胞吸入事先準(zhǔn)中，混勻后，1000rpm 離心 5min；

5

）準(zhǔn)備一個(gè) T-25 培養(yǎng)瓶，寫上細(xì)胞名稱、日期，再加入 4ml wan全備的離心管培養(yǎng)基；

6

）離心完成后棄去上清，用 1ml wan全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，轉(zhuǎn)入 T-25 細(xì)胞培養(yǎng)中，混勻后轉(zhuǎn)入O2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)靜置。

注意：從液氮中取出細(xì)胞凍存管時(shí)，若凍存管內(nèi)有液氮進(jìn)入，需擰松凍存管，排出內(nèi)部殘留的液氮，之后擰緊凍存管，置于干冰上，然后放入 37℃水浴中，避免溫差太大造成液氮快速氣化而爆炸。

傳代

（細(xì)胞傳代建議一傳二）

1.

當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到 85%以上時(shí)，可進(jìn)行傳代。

2.

在生物安全柜內(nèi)，打開培養(yǎng)瓶瓶口，收集瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基；

3.

向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入 3ml 無(wú)菌的 1×PBS  后，水平放置培養(yǎng)瓶，使 PBS 能夠浸潤(rùn)到培養(yǎng)瓶底面上所有的面積，吸棄 PBS；

4.

向瓶?jī)?nèi)加入消化液 1ml，浸潤(rùn)底面后放入 37℃ CO2 培養(yǎng)箱中孵育 1~2min；

5.

孵育完成后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞是否變圓飄起，若全部消化下來(lái)則直接向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入2ml 含 10%FBS 的wan全培養(yǎng)基中，將懸液吸入 15ml 離心管；
注：如還有部分細(xì)胞未消化下來(lái)，可采用分步消化：
① 準(zhǔn)備一個(gè)無(wú)菌的 15ml 離心管，加入 2ml 含 10%FBS 的wan全培養(yǎng)基；
② 將消化下來(lái)的細(xì)胞吸入①中的離心管內(nèi)中和（避免吹打）；
③ 向之前消化的培養(yǎng)瓶中加入 1ml 胰酶繼續(xù)消化 2min 左右，輕拍培養(yǎng)瓶，95%左右細(xì)胞脫落后加入 2ml 含 10%FBS 的wan全培養(yǎng)基中和，中和后的細(xì)胞懸液移入①中的離心管內(nèi)。
6.1000rpm 離心 5min；

7.

準(zhǔn)備兩個(gè)新的 T-25 培養(yǎng)瓶，各加入 4ml wan全培養(yǎng)基。

8.

離心完成后，棄上清，用 2mlwan全培養(yǎng)基重懸離心細(xì)胞，將重懸后的細(xì)胞轉(zhuǎn)入 2 個(gè) T-25 培養(yǎng)瓶，每個(gè)培養(yǎng)瓶各 1ml；

9.

水平放置培養(yǎng)瓶，震蕩混勻后，將培養(yǎng)瓶置于 37℃，5%CO2 培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

凍存

（細(xì)胞凍存建議每瓶 T25 凍一支）

1~6

）參照傳代步驟

7）離心完成后，棄上清，用 1mL 凍存液重懸細(xì)胞沉淀，然后轉(zhuǎn)入 1.8ml 凍存管中；

8）將凍存管轉(zhuǎn)入填充滿異丙醇的程序降溫盒中，之后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中過(guò)夜降溫；

9）第二天，取出降溫完成的序降溫盒中的凍存管，盡快轉(zhuǎn)入液氮罐中保存。