人纖溶酶原激活劑ELISA試劑盒是一種基于高特異性酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定技術(shù)的高靈敏度生物檢測(cè)工具，主要用于定量檢測(cè)血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液等樣本中的人組織型纖溶酶原激活劑的濃度。t-PA是人體內(nèi)關(guān)鍵的纖維蛋白溶解系統(tǒng)核心成分，由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌，負(fù)責(zé)將纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，進(jìn)而降解血栓中的纖維蛋白，在維持血液流動(dòng)性和預(yù)防心腦血管疾病中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

　　該試劑盒通常采用雙抗體夾心法原理進(jìn)行設(shè)計(jì)。其核心組件包括預(yù)先包被在微孔板上的抗人t-PA單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗人t-PA單克隆抗體以及高純度的t-PA標(biāo)準(zhǔn)品。檢測(cè)時(shí)，樣本中的t-PA與固相抗體結(jié)合，再加入酶標(biāo)抗體形成“抗體-t-PA-酶標(biāo)抗體”復(fù)合物。經(jīng)過(guò)嚴(yán)格洗滌去除未結(jié)合物質(zhì)后，加入底物顯色體系，溶液顏色的深淺與樣本中t-PA的濃度呈正比關(guān)系。通過(guò)酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值（OD值），利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)即可精確計(jì)算出待測(cè)樣本中t-PA的含量。

　　人纖溶酶原激活劑ELISA試劑盒的使用事項(xiàng)介紹：

　　一、試劑盒儲(chǔ)存與試劑準(zhǔn)備事項(xiàng)

　　整體儲(chǔ)存

　　整套試劑盒2～8℃避光冷藏；嚴(yán)禁冷凍包被板、TMB顯色液、酶結(jié)合物，凍融直接失效。

　　試劑平衡

　　所有試劑取出后室溫（20～25℃）平衡≥30min再開(kāi)始實(shí)驗(yàn)；濃縮洗滌液低溫出現(xiàn)結(jié)晶屬正常，37℃水浴完q溶解后再稀釋。

　　試劑配制硬性規(guī)則

　　濃縮洗滌液只用去離子水/蒸餾水稀釋?zhuān)豢勺詠?lái)水；稀釋后1×洗滌液2～8℃可存放1個(gè)月。

　　生物素抗體工作液、鏈霉親和素-HRP工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，當(dāng)日剩余全部丟棄，不可留存。

　　TMB顯色液避光保存；使用前應(yīng)為無(wú)色/極淡藍(lán)色，若自發(fā)變藍(lán)、渾濁，直接報(bào)廢。

　　未用完板條處理

　　不用的條板立即放回鋁箔袋，放入干燥劑，密封嚴(yán)實(shí)2～8℃保存，建議1個(gè)月內(nèi)用完；板條一旦干燥，抗體不可逆失活。

　　嚴(yán)禁混用

　　不同批號(hào)、不同品牌試劑盒試劑禁止互換；超過(guò)有效期禁止使用。

　　二、樣本采集、前處理（t-PA重點(diǎn)！極易踩坑）

　　1.血液樣本要求

　　1）血漿優(yōu)先推薦3.2%檸檬酸鈉抗凝（血：抗凝劑=9:1）；

　　EDTA、肝素血漿部分試劑盒存在基質(zhì)干擾，使用前務(wù)必參考說(shuō)明書(shū)驗(yàn)證；不推薦血清（凝血過(guò)程大量釋放t-PA，結(jié)果嚴(yán)重偏高）。

　　2）采血要點(diǎn)

　　止血帶捆扎時(shí)間盡量＜1min，長(zhǎng)時(shí)間壓迫血管內(nèi)皮釋放t-PA，數(shù)值假性升高；

　　采血順利，避免溶血、凝塊；溶血、嚴(yán)重脂血樣本舍棄。

　　3）分離流程（盡量冰上操作）

　　采血后30min內(nèi)1000～1500×g離心15min；吸取上層血漿，建議二次離心去除血小板（乏血小板血漿），血小板活化會(huì)持續(xù)釋放t-PA。

　　4）樣本保存

　　新鮮樣本盡快檢測(cè)；分裝凍存-20℃短期、-80℃長(zhǎng)期；嚴(yán)格避免反復(fù)凍融（≤2次）。

　　2.其他樣本

　　細(xì)胞上清、組織勻漿：勻漿全程冰浴，推薦添加蛋白酶抑制劑；離心去除細(xì)胞碎片，上清待測(cè)；渾濁樣本務(wù)必再次澄清。

　　重要干擾：體內(nèi)PAI-1（纖溶酶原激活物抑制物）可結(jié)合t-PA，若檢測(cè)活性t-PA與總t-PA抗原前處理方案不一樣，請(qǐng)區(qū)分試劑盒檢測(cè)指標(biāo)。

　　三、實(shí)驗(yàn)全程操作規(guī)范

　　加樣要求

　　標(biāo)準(zhǔn)品、樣本、每種試劑更換新吸頭，杜絕交叉污染；

　　液體加到孔底，不要貼孔壁、減少氣泡；氣泡會(huì)造成OD值偏差；

　　建議標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣本全部設(shè)置復(fù)孔；每次實(shí)驗(yàn)必須同步做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，不能沿用舊曲線(xiàn)。

　　孵育控制（影響重復(fù)性）

　　溫育全程加蓋配套封板膜，防止液體蒸發(fā)、孔內(nèi)干涸；酶標(biāo)板干燥直接報(bào)廢整板數(shù)據(jù)；

　　37℃恒溫箱溫度穩(wěn)定，避免開(kāi)門(mén)頻繁；孵育計(jì)時(shí)從最后一孔加樣完畢開(kāi)始。

　　洗板步驟（ELISA成敗核心）

　　每孔洗滌液≥300μL，每次浸泡30～60s；

　　手工洗板：甩凈液體后，在干凈吸水紙上充分拍干；不要擦拭孔底部；

　　洗滌不足：背景升高、假陽(yáng)性；洗滌過(guò)度：信號(hào)偏低、CV變大。

　　顯色操作

　　加入TMB后避光孵育；嚴(yán)格統(tǒng)一所有孔顯色時(shí)長(zhǎng)；顏色深淺差異較大時(shí)，可提前終止，不建議無(wú)限延長(zhǎng)。

　　終止與讀數(shù)

　　加入終止液輕輕震蕩混勻；終止后30分鐘內(nèi)，450nm讀取OD值；有條件選用600～650nm作為參比波長(zhǎng)扣除背景。

　　四、濃度超標(biāo)樣本處理

　　樣品OD高于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)最高點(diǎn)：不能直接外推計(jì)算！

　　用試劑盒自帶樣品稀釋液進(jìn)行梯度稀釋復(fù)測(cè)，稀釋后結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)；禁止使用PBS、生理鹽水稀釋?zhuān)ɑ|(zhì)效應(yīng)造成誤差）。

　　五、安全與廢棄物

　　樣本視為生物危險(xiǎn)源，全程佩戴手套；

　　終止液多為稀硫酸，避免皮膚接觸；

　　廢液可加入次氯酸鈉至終濃度1%，靜置30min滅活后處理。