豬旋毛蟲抗體ELISA試劑盒是一種專門用于檢測(cè)豬體內(nèi)旋毛蟲（Trichinella spiralis）特異性IgG抗體的體外診斷試劑。旋毛蟲病是一種重要的人畜共患寄生蟲病，豬通常因吞食受感染的嚙齒類動(dòng)物而感染。該試劑盒主要用于養(yǎng)殖場(chǎng)或屠宰場(chǎng)層面的豬群血清學(xué)監(jiān)測(cè)、流行病學(xué)調(diào)查及無(wú)旋毛蟲豬群的認(rèn)證。

　　在技術(shù)原理上，該試劑盒通常采用雙抗體一步夾心法或間接法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。其核心優(yōu)勢(shì)在于常采用高特異性的旋毛蟲幼蟲排泄-分泌（E/S）抗原，能有效消除假陽(yáng)性反應(yīng)，且與豬常見的其他寄生蟲無(wú)交叉反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將待檢血清或血漿樣本加入預(yù)先包被抗原的微孔板中，經(jīng)過(guò)溫育、洗滌后加入酶標(biāo)二抗和底物顯色。顏色的深淺與樣本中的抗體含量呈正相關(guān)，最終通過(guò)酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值）進(jìn)行定性或定量分析。

　　豬旋毛蟲抗體ELISA試劑盒的使用方法：

　　一、檢測(cè)原理

　　微孔板預(yù)先包被旋毛蟲幼蟲抗原；待測(cè)血清中旋毛蟲特異性IgG抗體與固相抗原結(jié)合；加入HRP標(biāo)記抗豬IgG；TMB底物顯色；酶標(biāo)儀讀取OD450，判斷抗體陰陽(yáng)性。

　　二、試劑盒組成（通用96T）

　　預(yù)制包被酶標(biāo)板、樣本稀釋液、20×濃縮洗滌液、HRP酶結(jié)合物、TMB顯色液、終止液、陽(yáng)性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清、封板膜。

　　三、樣本采集與預(yù)處理

　　樣本類型：豬血清（s選）；EDTA抗凝血漿可用，肝素血漿部分試劑盒存在干擾。

　　采血分離：靜脈采血，室溫靜置30min，3000 r/min離心10 min分離血清。

　　保存

　　短期（≤3d）：2～8℃冷藏；

　　長(zhǎng)期：-20℃冷凍，避免反復(fù)凍融；

　　樣本拒收標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重溶血、重度脂血、渾濁變質(zhì)樣本；樣本禁止添加疊氮鈉（NaN?），抑制過(guò)氧化物酶造成假陰性。

　　血清稀釋（通用1:50，國(guó)標(biāo)推薦稀釋比例）

　　10μL血清+490μL樣本稀釋液，充分混勻；臨現(xiàn)稀釋，不可久放。

　　四、試驗(yàn)前準(zhǔn)備

　　試劑盒全部試劑提前取出，室溫平衡20～30 min（20～25℃）；

　　濃縮洗滌液配制：20×濃縮洗滌液：純水=1:19稀釋，配成1×洗滌工作液；

　　??濃縮洗滌液低溫出現(xiàn)結(jié)晶，37℃溫水溶解后再稀釋；

　　設(shè)置孔位：空白孔、陰性對(duì)照孔、陽(yáng)性對(duì)照孔、待測(cè)樣本孔，建議樣本做復(fù)孔；

　　多余板條密封，2～8℃保存，防潮。

　　五、詳細(xì)操作步驟（通用流程）

　　步驟1：加樣（樣本結(jié)合）

　　空白孔：加入樣本稀釋液100μL；

　　陰性對(duì)照孔：稀釋后陰性血清100μL；

　　陽(yáng)性對(duì)照孔：稀釋后陽(yáng)性血清100μL；

　　待測(cè)孔：稀釋后待測(cè)血清100μL；

　　輕輕震蕩酶標(biāo)板混勻，貼上封板膜；

　　37℃恒溫孵育30 min（部分試劑盒60 min，以說(shuō)明書為準(zhǔn)）

　　步驟2：洗板

　　棄去孔內(nèi)液體，吸水紙上充分拍干；

　　每孔加滿1×洗滌液（250～300μL），靜置30～60 s，甩干；

　　重復(fù)洗滌4～5次，最后一次充分拍干，孔內(nèi)無(wú)殘留液體。

　　手工洗板禁止強(qiáng)力直沖孔底；洗板機(jī)調(diào)低壓力，防止包被抗原脫落。

　　步驟3：加入酶結(jié)合物

　　除空白孔外，每孔加入HRP酶結(jié)合物100μL；

　　換新封板膜，37℃孵育30 min。

　　步驟4：二次洗板

　　操作同步驟2，洗滌4～5次，徹d拍干。

　　步驟5：顯色

　　每孔加入TMB顯色液100μL；封板，37℃避光孵育10～15 min；

　　陽(yáng)性孔溶液變?yōu)樗{(lán)色，陰性孔基本無(wú)色。

　　步驟6：終止反應(yīng)

　　每孔加入終止液50μL，溶液由藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色；

　　終止后10 min內(nèi)完成讀數(shù)。

　　步驟7：讀數(shù)

　　酶標(biāo)儀設(shè)置：主波長(zhǎng)450 nm，參比波長(zhǎng)630 nm，讀取各孔OD值。

　　六、試驗(yàn)有效性判定（試驗(yàn)成立先決條件）

　　試驗(yàn)必須滿足以下條件，結(jié)果有效，否則試驗(yàn)作廢重測(cè)：

　　空白孔OD＜0.10；

　　陰性對(duì)照平均OD＜0.15；

　　陽(yáng)性對(duì)照平均OD＞0.5；

　　不同廠家臨界值公式略有差異，兩種主流判定方式：

　　方式A（固定Cutoff）：Cutoff=0.5；樣本OD＞0.5判陽(yáng)性，≤0.5陰性；

　　方式B（計(jì)算臨界值，應(yīng)用更廣）：

　　Cutoff值=陰性對(duì)照平均OD+0.25

　　樣本OD＞Cutoff：陽(yáng)性（檢出旋毛蟲抗體）

　　樣本OD≤Cutoff：陰性

　　接近Cutoff區(qū)間樣本判定為可疑，建議復(fù)檢或采用集樣消化法病原學(xué)確認(rèn)

　　重要提示：血清學(xué)陽(yáng)性僅代表產(chǎn)生抗體、既往或現(xiàn)癥感染；ELISA篩查陽(yáng)性樣品，按照國(guó)標(biāo)要求，需要消化法進(jìn)行病原確證。

　　七、關(guān)鍵操作注意事項(xiàng)

　　生物安全

　　血清屬于生物樣品，全程佩戴手套；廢棄物高壓滅菌處理；防止樣本交叉污染。

　　加樣規(guī)范

　　一次性吸頭，不同樣本更換槍頭；避免產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)干擾OD讀數(shù)；加樣順序統(tǒng)一。

　　孵育要求

　　恒溫箱溫度穩(wěn)定；封板膜一次性使用，防止交叉污染；避光顯色。

　　試劑禁忌

　　不同批次試劑盒組分嚴(yán)禁混用；TMB顯色液變色、發(fā)灰失效，禁止使用；終止液具有腐蝕性，避免接觸皮膚。

　　常見誤差來(lái)源

　　洗板不充分→非特異性結(jié)合，假陽(yáng)性；

　　孵育溫度不準(zhǔn)、時(shí)間縮短→信號(hào)偏低，假陰性；

　　血清反復(fù)凍融、樣本變質(zhì)；

　　孔內(nèi)殘留洗滌液稀釋底物。

　　時(shí)效性說(shuō)明

　　動(dòng)物感染旋毛蟲后，感染后3～4周才可檢出抗體；感染早期會(huì)出現(xiàn)血清學(xué)假陰性。

　　八、試劑盒保存與廢棄處理

　　未開封：2～8℃避光保存，禁止冷凍；

　　開封后板條密封防潮；稀釋后的洗滌液室溫可保存3天；

　　檢測(cè)廢液、廢棄板條按生物危險(xiǎn)廢物處置。

　　九、結(jié)果報(bào)告建議

　　陰性：未檢出旋毛蟲特異性抗體；

　　陽(yáng)性：檢出旋毛蟲抗體，建議采集肌肉樣本采用集樣消化法檢測(cè)幼蟲進(jìn)行確診；

　　可疑樣本：重新檢測(cè)，同時(shí)更換方法復(fù)核。