本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中小鼠堿性磷酸酶（AKP）水平。用純化的小鼠堿性磷酸酶（AKP）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入堿性磷酸酶（AKP），再與HRP標(biāo)記的堿性磷酸酶（AKP）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的堿性磷酸酶（AKP）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中小鼠堿性磷酸酶（AKP）活性濃度。

操作步驟：

試劑準(zhǔn)備‌：

所有試劑盒組分提前從冰箱取出，平衡至室溫（18-25℃）至少30分鐘；將30×濃縮洗滌液用蒸餾水按1：30比例稀釋，配制成1×工作洗滌液。

標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶與梯度稀釋：向160ng/L的AKP凍干粉標(biāo)準(zhǔn)品中加入1.5mL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，靜置10分鐘待溶解后，通過倍比稀釋依次配制出80ng/L、40ng/L、20ng/L、10ng/L、5ng/L的梯度標(biāo)準(zhǔn)工作液。

加樣溫育‌：

提前設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測樣本孔：空白孔不加任何液體，標(biāo)準(zhǔn)品孔每孔加入50μL不同濃度的梯度標(biāo)準(zhǔn)液，待測樣本孔中先加40μL樣品稀釋液，再加入10μL預(yù)處理好的樣本上清（樣本最終稀釋度為5倍）。

輕輕晃動酶標(biāo)板混勻，貼上封板膜，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育‌30分鐘。

洗板與酶促結(jié)合‌：

小心揭掉封板膜，棄去孔中液體，在吸水紙上拍干；每孔加滿1×洗滌液，靜置30秒后棄去，重復(fù)洗板‌5次‌，最后一次拍干孔內(nèi)殘留液體。

每孔加入酶標(biāo)試劑50μL（空白孔除外），重新貼好封板膜，37℃溫育‌30分鐘‌。

再次重復(fù)上述洗板操作5次，拍干孔內(nèi)液體。

色與終止讀數(shù)‌：

每孔依次加入顯色劑A液、B液各50μL，輕輕晃動混勻，37℃避光顯色‌10分鐘‌，此時可見標(biāo)準(zhǔn)品孔從高濃度到低濃度呈現(xiàn)明顯的藍(lán)色梯度。

每孔加入終止液50μL，輕輕晃動混勻，此時藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。

用酶標(biāo)儀在‌450nm波長‌下，15分鐘內(nèi)依次測定各孔的吸光度（OD值）。