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發(fā)布時(shí)間：2023/3/5
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乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（ChAT）測(cè)試盒說明書
一、測(cè)定原理：
乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(choline acetyltransferase ChAT)的測(cè)定是以乙酰輔酶 A 和膽堿為底物，在 ChAT 的作用下，反應(yīng)的生成物和顯色劑結(jié)合，在 324nm 處測(cè)定吸光度，以此計(jì)算 ChAT 的活力。
試劑一：液體 6mL×1 瓶，4℃保存。室溫低時(shí)會(huì)有結(jié)晶析出，測(cè)試前 37℃水浴至澄清。
試劑二：粉劑×1 支，臨用前加 220μL 的蒸餾水，充分溶解；用不完的試劑-20℃以下保存。
試劑三：粉劑×1 支，臨用時(shí)每支加雙蒸水 440μL，用不完的試劑-20℃以下保存。
試劑四：液體×1 支，臨用前每支用雙蒸水 1:1 稀釋，4℃保存。
試劑五：液體×1 支，4℃保存。
試劑六：液體×1 支，4℃保存。試劑七：液體×1 支，4℃保存。
1、樣本前處理：
10%勻漿液的制備：準(zhǔn)確稱取組織重量，按重量（g）：體積(mL)=1：9 的比例，加入 9 倍體積的生理鹽水，2500 轉(zhuǎn)/分，離心 10 分鐘，取上清液，再用生理鹽水 2 倍稀釋后測(cè)定；
測(cè)定管 | 對(duì)照管 | |
試劑一（μL） | 105 | 105 |
試劑二（μL） | 5 | 5 |
試劑三（μL） | 10 | 10 |
試劑四（μL） | 10 | 10 |
試劑五（μL） | 10 | 10 |
試劑六 (μL) | 10 | 10 |
混勻，37°C 水浴預(yù)溫 5 分鐘 | ||
5%的組織勻漿上清（μL） | 25 | (煮沸的勻漿上清)25 |
混勻，37°C 水浴 20 分鐘，100°C 沸水水浴 2 分鐘終止反應(yīng) | ||
蒸餾水 （μL） | 425 | 425 |
混勻,4000 r/min×10min 離心后取上清進(jìn)行顯色反應(yīng) | ||
上清 （μL） | 500 | 500 |
試劑七（μL） | 10 | 10 |
混勻，靜置 15 分鐘，在 324nm 處，用 1cm 光徑，2mm 內(nèi)徑的石英比色皿，蒸餾 水調(diào)零，測(cè)定各管的吸光度值。 | ||
乙酰膽堿 Ach 是調(diào)節(jié)食道平滑肌運(yùn)動(dòng)的主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。食道平滑肌收縮主要是由于 Ach 釋放引起。而乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(Choline acetyltransferase ChAT)和乙酰膽堿脂酶(Acetylcholinesterase ACHE)分別是
Ach 的合成酶和水解酶，調(diào)節(jié) Ach 的代謝。食道組織中這兩個(gè)酶的活力代表了食管內(nèi)源性膽堿能神經(jīng)功能狀態(tài)。
乙酰膽堿是延髓脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，自主神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)節(jié)前纖維，神經(jīng)節(jié)后膽堿能(副交感神經(jīng))纖維，以 及中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)許多神經(jīng)元(例如基底節(jié)，大腦運(yùn)動(dòng)區(qū)皮層)的主要神經(jīng)遞質(zhì)。它是通過膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的 作用，由膽堿與來自線粒體的乙酰輔酶 A 所合成。在獲得釋放后，乙酰膽堿刺激特殊的膽堿能受體，這種相互作用很快被局部的膽堿酯酶所終止，后者使乙酰膽堿被水解為膽堿與乙酸鹽。乙酰膽堿的水平由膽堿乙 酰轉(zhuǎn)移酶和膽堿的攝取所調(diào)控。
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