4-香豆酸：輔酶 A 連接酶（ 4-coumarate:CoA ligase，4CL)

試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法 100 管/48 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

4CL 是連接苯丙酸途徑與木質(zhì)素特異合成途徑的關(guān)鍵酶，主要催化肉桂酸生成相應(yīng)的肉桂酸輔酶 A 酯，是合成木質(zhì)素與其他苯丙烷類化合物的代謝流向調(diào)控點(diǎn)。該酶主要存在于高等植物、酵母和菌類中，研究該酶可以探討多種生物細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中木質(zhì)素沉積的代謝機(jī)理， 為減少水果石細(xì)胞含量而提高其品質(zhì)提供依據(jù)。

測(cè)定原理：

4CL 催化 4-香豆酸和 CoA 生成 4-香豆酸 CoA，在 333nm 下測(cè) 4-香豆酸 CoA 生成速率，即可反映 4CL 活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：100mL×1  瓶，4℃保存；

試劑一：液體 25 mL×1 瓶， 4℃保存； 試劑二：粉劑×2 瓶，-20℃保存；

粗酶液提?。?/h3>

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量

（104 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀 40℃預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 333nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 準(zhǔn)備 96 孔 UV 板一塊（非普通酶標(biāo)板，普通酶標(biāo)板只能透過(guò)可見(jiàn)光，不能透過(guò)紫外光， 檢測(cè)波長(zhǎng)小于 340nm 務(wù)必使用 UV 板）。

3、 樣本測(cè)定

（1）   在試劑二中加入 5mL 試劑一充分溶解混勻，置于 40℃水浴預(yù)熱 10min；現(xiàn)配現(xiàn)用（ 配好后 24h 內(nèi)用完）；

（2）   對(duì)照管：在微量石英比色皿或 96 孔 UV 板中加入 10μL 樣本和 190μL 試劑一，混勻，立即記錄 333nm 處 40℃反應(yīng) 30min 后的吸光值A(chǔ)1。

（3）   測(cè)定管：在微量石英比色皿或 96 孔 UV 板中加入 10μL 樣本和 190μL 試劑二，混勻，立即記錄 333nm 處 40℃反應(yīng) 30min 后的吸光值 A2，計(jì)算 ΔA=A2-A1。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

4CL 活性計(jì)算：

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol4-香豆酸輔酶A 定義為一個(gè)酶活力單位。

4CL（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10 9]÷(V 樣×Cpr) ÷T= 31.75×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol 4-香豆酸輔酶A 定義為一個(gè)酶活力單位。

4CL（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10 9]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T= 31.75×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol 4-香豆酸輔酶A 定義為一個(gè)酶活力單位。

4CL（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10 9]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T= 0.063×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10 -4 L；ε：4-香豆酸輔酶 A 摩爾消光系數(shù)，2.1×10 4 L / mol /cm；

d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；

T：反應(yīng)時(shí)間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。

b. 用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 的 4-香豆酸輔酶A 定義為一個(gè)酶活力單位。

4CL（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10 9]÷(V 樣×Cpr) ÷T= 63.49×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol 4-香豆酸輔酶A 定義為一個(gè)酶活力單位。

4CL（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10 9]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T= 63.49×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol 4-香豆酸輔酶A 定義為一個(gè)酶活力單位。

4CL（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10 9]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T= 0.127×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10 -4 L；ε：4-香豆酸輔酶 A 摩爾消光系數(shù)，2.1×10 4 L / mol /cm；

d：96 孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；

T：反應(yīng)時(shí)間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。