丙酮酸磷酸雙激酶（PPDK)試劑盒說明書

                                          微量法100管/96樣

注    意：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

丙酮酸磷酸雙激酶（pyruvate phosphate dikinase, PPDK, EC 2.7.9.1）是C4途徑和景天科酸代謝途徑的限速酶，催化ATP、丙酮酸和Pi經三步反應生成磷酸烯醇式丙酮酸。該酶主要存在于C4植物的葉綠體基質中，對光合功能具有重要調節(jié)作用。

測定原理：

PPDK的逆向反應催化磷酸烯醇式丙酮酸、AMP和PPi生成丙酮酸、ATP和Pi，乳酸脫氫酶進一步催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD⁺，在340nm測定NADH減少速率，計算PPDK活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體25 mL×1瓶， 4℃保存；

試劑二：粉劑×2瓶，-20℃保存；

試劑三 ：液體40μL×1支，4℃保存；體積較少，若沾在管壁上，臨用前可低速離心后使用。

樣本的前處理：

按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟和加樣表：

1、   分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至340nm，蒸餾水調零。

2、   樣本測定

（1）工作液的配制：臨用前取試劑二一瓶加入10mL試劑一和5μL試劑三，充分混勻，置于37℃水浴5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和190μL工作液，混勻，立即記錄340nm處初始吸光值A1和37℃反應5min后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2。

PPDK活性計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PPDK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PPDK（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=643×ΔA÷W

V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PPDK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PPDK（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=1286×ΔA÷W

V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g。