硫氧還蛋白氧化還原酶（thioredoxin reductase, TrxR）試劑盒說明書

                                                  微量法100T/96S

注    意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

TrxR是一種NADPH依賴的包含FAD結構域的二聚體硒酶，屬于吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶家族成員，與硫氧還蛋白以及NADPH共同構成了硫氧還蛋白系統(tǒng)。TrxR與GR活性類似，催化GSSG還原生成GSH，是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)關鍵酶之一。

測定原理：

TrxR催化NADPH還原DTNB生成TNB和NADP⁺，TNB在412 nm有特征吸收峰，通過測定412nm波長處TNB的增加速率，即可計算TrxR活性。

自備儀器和用品：

低溫離心機、可調(diào)節(jié)移液器、可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體120mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體2mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑三：粉劑×1管，4℃保存。臨用前加入2mL蒸餾水溶解。

粗酶液提取：

1.        組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。

2.        細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

3.  血清等液體：直接測定。

TrxR測定操作：

1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min，調(diào)節(jié)波長到412nm，用蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑一在25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動物）預熱30min。

3. 空白管：取微量玻璃比色皿或96孔板，加入20μL試劑二，20μL試劑三，160μL試劑一，迅速混勻后于412 nm測定10 s和310 s吸光度，記為A1和A2。△A空白管=A2-A1。

4. 測定管：取微量玻璃比色皿或96孔板，加入20μL試劑二，20μL試劑三，140μL試劑一，20μL上清液，迅速混勻后于412 nm測定10 s和310 s吸光度，記為A3和A4。△A測定管=A4-A3。

注意：空白管只需測定一次。

TrxR活性計算公式：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個酶活單位。

TrxR（nmol/min /mg prot）=（△A測定管-△A空白管）÷ε÷d×V反總÷(Cpr×V樣)÷T

= 147×（△A測定管-△A空白管）÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每克樣本每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個酶活單位。

TrxR（nmol/min /g 鮮重）=（△A測定管-△A空白管）÷ε÷d×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T

= 147×（△A測定管-△A空白管）÷W

（3）按細胞數(shù)量計算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每10⁴個細胞每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個酶活單位。

TrxR（nmol/min/10⁴ cell）=（△A測定管-△A空白管）÷ε÷d×V反總÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

= 147×（△A測定管-△A空白管）÷ 細胞數(shù)量

（4）按液體體積計算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每毫升液體每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個酶活單位。

TrxR（nmol/min /mL）=（△A測定管-△A空白管）÷ε÷d×V反總÷V樣÷T

= 147×（△A測定管-△A空白管）

ε：TNB在412nm處的微摩爾消光系數(shù)，0.0136 L/μ mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應體系總體積（L），200μL=2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測定；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應體系中上清液體積（mL），20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應時間（min），5 min。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個酶活單位。

TrxR（nmol/min /mg prot）=（△A測定管-△A空白管）÷ε÷d×V反總÷(Cpr×V樣)÷T

= 294×（△A測定管-△A空白管）÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每克樣本每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個酶活單位。

TrxR（nmol/min /g 鮮重）=（△A測定管-△A空白管）÷ε÷d×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T

= 294×（△A測定管-△A空白管）÷W

（3）按細胞數(shù)量計算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每10⁴個細胞每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個酶活單位。

TrxR（nmol/min/10⁴ cell）=（△A測定管-△A空白管）÷ε÷d×V反總÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

= 294×（△A測定管-△A空白管）÷ 細胞數(shù)量

（4）按液體體積計算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每毫升液體每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個酶活單位。

TrxR（nmol/min /mL）=（△A測定管-△A空白管）÷ε÷d×V反總÷V樣÷T

= 294×（△A測定管-△A空白管）

ε：TNB在412nm處的微摩爾消光系數(shù)，0.0136 L/μ mol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V反總：反應體系總體積（L），200μL=2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測定；W ：樣品質(zhì)量；V樣：

加入反應體系中上清液體積（mL），20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應時間（min），5 min。

注意事項：

1.        測定前須先取1～2個樣做預實驗，哺乳動物組織及血液制品TrxR活力測定時，一般須用蒸餾水稀釋5倍左右；測定過程操作須迅速。

2.        試劑二和試劑三配制好后3天內(nèi)使用完。