線粒體復(fù)合體Ⅴ試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                          微量法100管/48樣

注   意 ：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

線粒體復(fù)合體Ⅴ又稱(chēng)F₁F₀-ATP合酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，由F1和F0兩個(gè)亞單位組成。該酶利用呼吸鏈產(chǎn)生的質(zhì)子電化學(xué)梯度催化ATP合成，也可逆過(guò)程水解ATP。此外，復(fù)合體Ⅴ還存在于葉綠體、異養(yǎng)菌和光合細(xì)菌中。復(fù)合體Ⅴ是線粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP的關(guān)鍵酶。

測(cè)定原理：

復(fù)合體Ⅴ水解ATP產(chǎn)生ADP和Pi，通過(guò)測(cè)定Pi增加速率來(lái)測(cè)定復(fù)合體Ⅴ活性。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一：100mL×1瓶，-20℃保存；

試劑二：80mL×1瓶，-20℃保存；

試劑三：2 mL×1瓶，-20℃保存；

試劑四：粉劑×1支，-20℃保存；臨用前加入2mL蒸餾水，充分溶解備用，用不完的試劑仍-20℃保存;

試劑五：8mL×1瓶，4℃保存；

試劑六：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入4mL蒸餾水，充分混勻；溶解后4℃保存一周；

試劑七：粉劑×1瓶, 4℃保存；臨用前加入10mL蒸餾水，充分混勻；溶解后4℃保存一周；

試劑八：粉劑×1瓶, 4℃保存；臨用前加入10mL蒸餾水，充分混勻；溶解后4℃保存一周；

試劑九：液體10mL×1 瓶，室溫保存。

定磷試劑的配制：按H₂O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷試劑應(yīng)為淺黃色。若無(wú)色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染（請(qǐng)根據(jù)需要，用多少配多少）。

注意：配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

①        準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

②        將勻漿600g，4℃離心5min。

③        棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

④        上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅴ（此步可選做）。

⑤        步驟④中的沉淀即為線粒體，加入800uL試劑二和8uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10秒，重復(fù)30次），用于復(fù)合體Ⅴ酶活性測(cè)定。

測(cè)定步驟：

1、酶促反應(yīng)（在EP管中加入下列試劑）

混勻， 37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）準(zhǔn)確水浴30min

混勻，4000g，25℃離心10min，取上清液

2、定磷(在EP管或96孔板中加入下列試劑）

混勻，室溫靜置10min后，在 660nm處讀取A測(cè)定管和A對(duì)照管，計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

復(fù)合體Ⅴ活性計(jì)算：

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下：

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 1.274x + 0.004；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mmol/L），y為A值。

1、組織中復(fù)合體Ⅴ活性的計(jì)算:

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。

 復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min/mg prot）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反總×10⁶]÷(V樣×Cpr) ÷T

                         =62.8× (ΔA-0.004) ÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。

 復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min /g 鮮重）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反總×10⁶]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T =50.7× (ΔA-0.004) ÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。

復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min /10⁴ cell）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反總×10⁶]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.101× (ΔA-0.004)

V反總：反應(yīng)體系總體積，1.2×10^-4 L； V樣：加入樣本體積，0.05 mL；V樣總：加入提取液體積，0.808 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn)。

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 0.637x + 0.004；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mmol/L），y為A值。

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。

 復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min /mg prot）=[(ΔA-0.004) ÷0.637×V反總×10⁶]÷(V樣×Cpr) ÷T

 =125.6× (ΔA-0.004) ÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。

 復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min /g 鮮重）=[(ΔA-0.004)÷0.637×V反總×10⁶]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T

                         =101.5× (ΔA-0.004) ÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。

復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min /10⁴ cell）=[(ΔA-0.004)÷0.637×V反總×10⁶]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T

                         =0.203× (ΔA-0.004)

V反總：反應(yīng)體系總體積，1.2×10^-4 L； V樣：加入樣本體積，0.05 mL；V樣總：加入提取液體積，0.808 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn)。