黃嘌呤氧化酶（xanthione oxidase, XOD）試劑盒說明書

                                         微量法100管/96樣

注   意 ：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

XOD（EC 1.17.3.2）催化黃嘌呤氧化生成尿酸和超氧陰離子，是活性氧主要來源之一；同時(shí)也是核苷酸代謝的關(guān)鍵酶之一。XOD主要分布于哺乳動(dòng)物的心，肺，肝臟等組織中，當(dāng)肝功能受損時(shí)，XOD大量釋放到血清中，對(duì)肝損害的診斷具有特異性的意義。

測(cè)定原理：

XOD催化黃嘌呤產(chǎn)生尿酸，尿酸在290nm下有特征吸收峰。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：30mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×2瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

操作步驟：

1、  分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至290nm，蒸餾水調(diào)零。

2、   XOD檢測(cè)工作液的配制：用時(shí)在每瓶試劑二中加入15mL試劑一，充分混勻，待用；現(xiàn)配現(xiàn)用；

3、   測(cè)定前將XOD檢測(cè)工作液在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴10min以上。

4、   準(zhǔn)備96孔UV板一塊（非普通酶標(biāo)板，普通酶標(biāo)板只能透過可見光，不能透過紫外光，檢測(cè)波長(zhǎng)小于340nm務(wù)必使用UV板）。

5、在微量石英比色皿或96孔UV板中加入10μL樣本和250μL工作液，立即混勻并計(jì)時(shí)，記錄290nm下初始吸光值A1和1min后的吸光值A2。計(jì)算ΔA＝A2-A1。

XOD活性計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）XOD計(jì)算：

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 尿酸定義為一個(gè)酶活力單位。

XOD（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=2131×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中XOD計(jì)算：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 尿酸定義為一個(gè)酶活力單位。

XOD（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr)÷T =2131×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 尿酸定義為一個(gè)酶活力單位。

XOD（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W ×V樣÷V樣總）÷T=2131×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每一萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 尿酸定義為一個(gè)酶活力單位。

XOD（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=4.26×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2.6×10^-4 L；ε：尿酸摩爾消光系數(shù)，1.22×10⁴ L/ mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）XOD計(jì)算：

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 尿酸定義為一個(gè)酶活力單位。

XOD（nmol/min/mL）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=4262×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中XOD計(jì)算：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 尿酸定義為一個(gè)酶活力單位。

XOD（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr)÷T =4262×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 尿酸定義為一個(gè)酶活力單位。

XOD（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V樣÷V樣總）÷T =4262×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每一萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 尿酸定義為一個(gè)酶活力單位。

XOD（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=8.52×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2.6×10^-4 L；ε：尿酸摩爾消光系數(shù)，1.22×10⁴ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。