超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）試劑盒說明書（NBT 法）

微量法 100 管/96 樣

注　意：正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

SOD（EC 1.15.1.1）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，催化超氧化物陰離子發(fā)生岐化作用，生成 H2O2 和 O2。SOD 不僅是超氧化物陰離子清除酶，也是 H2O2 主要生成酶，在生物抗氧化系統(tǒng)中具有重要作用。

測定原理：

通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子(O2-)，O2-可還原氮藍(lán)四唑生成藍(lán)色甲臜，后者在 560nm 處有吸收；SOD 可清除 O2-，從而抑制了甲臜的形成；反應(yīng)液藍(lán)色越深，說明 SOD 活性愈低，反之活性越高。

需自備的儀器和用品：

酶標(biāo)儀、離心機(jī)、移液器、96 孔板、研缽、冰和蒸餾水

試劑的組成和配制：

提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 5mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體 200μL×1 支，4℃保存；

試劑三：液體 4mL×1 瓶，4℃保存；

試劑四：粉劑×2 瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 560nm。

2、 將試劑二用蒸餾水稀釋兩倍，用多少配多少。（試劑二和蒸餾水 1：1 稀釋）

3、 將一瓶試劑四用 5mL 蒸餾水溶解（溶解后一周內(nèi)用完），再用蒸餾水稀釋 4 倍，用多少配多少（試劑四和蒸餾水 1：3 稀釋）。

4、 測定前將試劑一、三和四在 37℃（哺乳動物）或 25℃（其他物種）水浴 5min 以上。

5、樣本測定（在 EP 管或 96 孔板中依次加入下列試劑）

　充分混勻，室溫靜置 30min 后，560nm 處測定各管吸光值 A。

注意事項：

1、試劑二為酶，不可冷凍，使用時在冰上放置。

2、對照管只需要做一管。

3、若對照管吸光值大于 1，建議將試劑二用蒸餾水稀釋 7 倍后使用（10μL 試劑二原液+60μL蒸餾水）。

4、SOD 為什么有的樣本測定管大于對照管，對照管數(shù)值在什么范圍？

對照管的范圍是 0.4-1。對照管吸光值過低可能是

（1）試劑二或試劑四沒有現(xiàn)配現(xiàn)用；

（2)　沒有按順序加試劑；

（3）反應(yīng)時間不夠，可以延長反應(yīng)時間（反應(yīng)時間 30min 可以延長到 40min）。對照管吸光值過高可能是試劑二未按操作說明書稀釋相應(yīng)倍數(shù)。若出現(xiàn)測定管大于對照管，可能是樣本中雜質(zhì)的影響太大，為了降低雜質(zhì)的影響一般將樣本提取上清液用蒸餾水或提取液稀釋 10 倍后再測，通?？梢允箿y定正常。計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

SOD 活性計算：

1、抑制百分率的計算

抑制百分率＝(A 對照管－A 測定管) ÷A 對照管× 100%

盡量使樣本的抑制百分率在 10-90%范圍內(nèi)。如果計算出來的抑制百分率小于 10%或大于90%，則通常需要調(diào)整加樣量后重新測定。如果測定出來的抑制百分率偏高，則需將樣本用提取液適當(dāng)稀釋；如果測定出來的抑制百分率偏低，則需重新準(zhǔn)備濃度比較高的待測樣本。

2、SOD 酶活性單位：

在上述黃嘌呤氧化酶藕聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為 50%時，反應(yīng)體系中的 SOD 酶活力定義為一個酶活力單位(U/mL)。

3、SOD 酶活性計算：

（1）血清（漿）SOD 活性(U/mL)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V 反總]÷V 樣

=11.11×抑制百分率÷(1－抑制百分率)

（2）組織、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞

SOD 活力計算：

a.按樣本蛋白濃度計算

SOD 活性(U/mg prot)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V 反總]÷(V 樣×Cpr)

=11.11×抑制百分率÷(1－抑制百分率)÷Cpr需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

b.按樣本鮮重計算

SOD 活性(U/g 鮮重)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V 反總]÷(W ×V 樣÷V 樣總) =11.11×抑制百分率÷(1－抑制百分率)÷W

c.按細(xì)菌或細(xì)胞個數(shù)計算

SOD 活力(U/104 cell)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率) ×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)

=0.022×抑制百分率÷(1－抑制百分率)

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.018mL；

V 樣總：加入提取液體積，1 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL ；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬。