【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：禽腦脊髓炎病毒（AEV）核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法)

Name：Diagnostic Kit for Avian Encephalomyelitis Virus RNA (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預(yù)期用途】

本試劑盒適用于檢測腦組織、胰腺、腺胃、全血等標(biāo)本中禽腦脊髓炎病毒 RNA，適用于禽腦脊髓炎病毒感染的輔助診斷。其檢測結(jié)果僅供參考。

【檢驗原理】

本試劑盒用一對禽腦脊髓炎病毒特異性引物，結(jié)合一條特異性熒光探針，用一步法熒光 RT-PCR 技術(shù)對禽腦脊髓炎病毒 RNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測，用于臨床上對可疑感染病料的病原學(xué)診斷。

【試劑組成】

包裝規(guī)格50T/盒

AEV 反應(yīng)液500μL×2 管

酶液50μL×1 管

AEV 陽性質(zhì)控品50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品250μL ×1 管

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標(biāo)本采集】

病死或撲殺禽的腦組織、胰腺、腺胃 2g；待檢活禽，用注射器取血 5mL 至 EDTA-2Na 抗凝管。

【保存和運(yùn)輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸， 嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

每份組織分別從不同的位置稱取樣品約 1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；全血樣品待血凝后取血清 100μL，置于 1.5mL 離心管中。

1.2核酸提取

推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑（離心柱法）進(jìn)行核酸提取，請按照試劑說    明書進(jìn)行操作。

2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；反應(yīng)管數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑AEV 反應(yīng)液酶液

用量19μL1μL

將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，20μL /管。

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 5μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻， 短暫離心。

4.PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；熒光通道選擇：

檢測通道（ReporterDye）FAM，淬滅通道（QuencherDye）NONE，光。ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光， 選擇 None 即可。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號

11 cycle50℃10min否

21 cycle95℃2min否

345 cycles95℃15sec否

60℃30sec是

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定（請參照各儀器使用說明書進(jìn)行設(shè)置，以分析 ABI7500 儀器為例）

反應(yīng)結(jié)束后自動保存結(jié)果，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整，Start 值可設(shè)在 3～15、End 值可設(shè)在 5～20，使閾值線位于擴(kuò)增曲線指數(shù)期，陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線平直或低于閾值線），點(diǎn)擊 Analyze 自動獲得分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤40，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線； 陰性：樣本檢測結(jié)果 Ct 值>40 或無 Ct 值。

5.3質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：無特異性擴(kuò)增曲線或無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效。

6.檢測方法的局限性

1.樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

3.陽性對照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

5.不同的提取方法存在提取效率差異，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

6.試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果；

7.本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

1.所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行；

2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完-全混勻并短暫離心；

3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；

7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通則》進(jìn)行處理。

【參考文獻(xiàn)】

[1]孫石開,劉闖,魯俊鵬,等.禽肺病毒研究進(jìn)展[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2012.

[2]謝志勤,謝芝勛,范晴,等.H9 亞型禽-流-感病毒和禽肺病毒二重 RT-PCR 檢測方法的建立[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2016.