【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：豬多殺性巴氏桿菌（SPA）核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法) 

Name：Swine Pasteurellosis Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預期用途】

多殺性巴氏桿菌是一種常見病原菌，可感染豬、牛、家禽等多種動物，引起豬肺疫、牛出血性敗血癥、禽霍   亂等多種臨床疾病[1]。

本試劑盒適用于檢測氣管分泌物拭子、肺組織等樣本中的豬多殺性巴氏桿菌，用于豬多殺性巴氏桿菌感染的   輔助診斷。

【檢驗原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術，設計一對豬多殺性巴氏桿菌特異性引物，結(jié)合一條特異性探針[2]，用熒光 PCR 技術對豬多殺性巴氏桿菌的 DNA 進行體外擴增檢測，用于科研實驗中對可疑感染者的病原學檢測。

【試劑組成】

包裝規(guī)格50T/盒

SPA 反應液500μL×2 管

酶液50μL×1 管

SPA 陽性質(zhì)控品50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品250μL ×1 管

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

病死或撲殺豬，無菌采集肺病變部位或病變/非病變部位交界處的樣品；生豬滅菌棉拭子沾取氣管分泌物，   放入無菌試管中

【保存和運輸】

上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸， 嚴禁反復凍融。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

組織樣品：稱取樣品約 1g，手術剪剪碎混勻后于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中

1.2核酸提取

推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進行核酸提取，請按照    試劑說明書進行操作。

2.試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；反應管數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：

試劑SPA 反應液酶液

用量（樣本數(shù)為 N）20μL1μL

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，21μL/管。

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi)；

4.2設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇

ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設置：

步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號

11 cycle95℃10min否

240 cycles94℃15sec否

55℃30sec是

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設定

設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線；

可疑：檢測通道 35<Ct 值≤38，建議重復檢測，如果檢測通道仍為 35<Ct 值≤38，且曲線有明顯的增長曲線， 判定為陽性，否則為陰性；

陰性：樣本檢測結(jié)果 Ct 值>38 或無 Ct 值。

6.質(zhì)控標準

陰性質(zhì)控品：Ct 值>38 或無 Ct 值；

陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。

7.檢測方法的局限性

1.樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關；

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

3.陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導致假陽性結(jié)果；

4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結(jié)果；

5.不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結(jié)果；

6.試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果；

7.本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

1.所有操作嚴格按照說明書進行；

2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化，完-全混勻并短暫離心；

3.反應液應避光保存；

4.反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。

【參考文獻】

[1]曾靜雯, 劉慧芳, 沈琴芳, 等. 多殺性巴氏桿菌鑒定與特性研究的分子生物學方法[J]. 中國獸藥雜志, 2006.

[2]李鵬, 馬艷嬌, 夏偉, 等. 豬肺炎支原體、多殺性巴氏桿菌和豬胸膜肺炎放線桿菌三重 PCR 檢測方法的建立. 中國預防獸醫(yī)學報, 2010.