轉(zhuǎn)基因大豆EPSPS基因核酸檢測(cè)試劑盒(熒光-PCR 法)

 【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：轉(zhuǎn)基因大豆EPSPS基因核酸檢測(cè)試劑盒(熒光-PCR 法) 

Name ：EPSPS Gene Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預(yù)期用途】

5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)可以阻斷草甘膦對(duì)生物合成途徑的干擾，從而使菌種或植物不被草甘膦殺滅。因此，農(nóng)作物中轉(zhuǎn)入該基因，增加農(nóng)作物對(duì)草甘膦抗性，使草甘膦只作用于雜草，而不影響作物生長(zhǎng)。熒光 PCR 技術(shù)因其靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中發(fā)揮了重要作用。

本試劑盒適用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物的 EPSPS 基因，用于篩查待檢測(cè)植物中是否含有 EPSPS 成分。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒根據(jù) EPSPS 基因序列設(shè)計(jì)特異性的引物和探針[1-3]，用熒光 PCR 技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)。

【試劑組成】

1）  不同批號(hào)試劑不能混用。

2）  試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測(cè)次數(shù)。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

-20℃避光保存、運(yùn)輸、避免反復(fù)凍融，有效期 12 個(gè)月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、MJ Opticon2、LightCycler480、Bio-Rad、eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測(cè)儀。

【標(biāo)本采集】

稱取 200g 樣品。

【保存和運(yùn)輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長(zhǎng)期保存可置-70℃，但不能超過(guò) 6 個(gè)月，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 0℃冰壺。

【使用方法】

1.  樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1  樣本前處理

固體樣本：用粉碎機(jī)或冷凍研磨儀將樣品研磨至細(xì)粉狀。

1.2  DNA 提取

推薦采用公司生產(chǎn)的 DNA/提取試劑盒（離心柱提取法），請(qǐng)按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

2.  試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：

將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，21uL/管。

3.  加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 DNA、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.  PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1 將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2 設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25ul；熒光通道選擇： 檢測(cè)通道

（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）選擇 NONE，ABI 系列儀器請(qǐng)勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

5.  結(jié)果分析判定

5.1  結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí)，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對(duì)照)，重新分析結(jié)果。

5.2  結(jié)果判斷

陽(yáng)性：檢測(cè)通道 Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線；

可疑：檢測(cè)通道 35<Ct 值≤38，建議重復(fù)檢測(cè)，如果檢測(cè)通道仍為 35<Ct 值≤38，且曲線有明顯的增長(zhǎng)曲線，判定為陽(yáng)性，否則為陰性；

陰性：樣本檢測(cè)結(jié)果 Ct 值>38 或無(wú) Ct 值。

6.  質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：Ct>38 或無(wú) Ct 值顯示；

陽(yáng)性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期，且 Ct 值≤32；以上條件應(yīng)同時(shí)滿足，否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。

7.  檢測(cè)方法的局限性

? 樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

? 樣本提取過(guò)程中沒(méi)有控制好交叉污染，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；

? 陽(yáng)性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果；

? 病原體在流行過(guò)程中基因突變、重組，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

? 不同的提取方法存在提取效率差異，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

? 試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果；

? 本檢測(cè)結(jié)果僅供參考，如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。

【注意事項(xiàng)】

? 所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行；

? 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，wan全混勻并短暫離心；

? 反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

? 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；

? 實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器；

? 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。.

【參考文獻(xiàn)】

[1] 中國(guó)農(nóng)業(yè)部. 1861 號(hào)公告-5-2012 轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè) CP4-epsps 基因定性 PCR 方法[S]. 北京: 科學(xué)出版社, 2012.

[2] 韓強(qiáng), 劉瑞芳, 陸玲鴻, 等. 實(shí)時(shí)熒光 PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆外源基因的拷貝數(shù)[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2016 , 30 (4) :646-653.

[3] 岳巖磊. EPSPS 基因直接作為大豆遺傳轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記的研究[J]. 哈爾濱師范大學(xué), 2012.