豬血凝性腦脊髓炎病毒探針法RT-PCR試劑盒

產(chǎn)品名稱：豬血凝性腦脊髓炎病毒探針法RT-PCR試劑盒

英文名稱：Porcine Hemagglultinating Encephalomyelitis Virus(PHEV) Probe qRT-PCR Kit

豬血凝性腦脊髓炎病毒(Porcine Hemagglultinating Encephalomyelitis Virus,PHEV)是一種 RNA 病毒，會(huì)引起血凝性腦脊髓炎，是豬的一種急性傳染病，發(fā)生于出生后 4-7 天的仔豬，體溫短暫升高，先是食欲廢絕，隨后出現(xiàn)嗜睡、嘔吐、便秘。病豬背毛倒立、四肢藍(lán)色，有部分病豬打噴嚏、咳嗽、磨牙。1-3 天后出現(xiàn)中樞神經(jīng)癥狀、步態(tài)不穩(wěn)、趴地、發(fā)抖或痙攣、后肢逐漸麻痹。感覺過敏，遇突然聲響或擾動(dòng)便發(fā)出嚎叫，最后病豬側(cè)臥，四肢做游泳動(dòng)作，呼吸困難，  眼失明，眼球震顫、昏迷死亡，因此豬血凝性腦脊髓炎病毒的快速準(zhǔn)確鑒定對(duì)該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 RT-PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測(cè)的試劑盒,它具有下列特點(diǎn):

1.    即開即用，用戶只需要提供樣品 RNA 模板。

2.    引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏性高。

3.    提供陽性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4.    特異性高，引物是根據(jù)豬血凝性腦脊髓炎病毒高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他  病毒的 RNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。

5.    既可用于定性檢測(cè)，又可用于定量檢測(cè)。用于定量檢測(cè)時(shí)線性范圍至少為 5 個(gè)數(shù)量級(jí)。

6.    本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應(yīng)。

7.    本產(chǎn)品只能用于科研。

【試劑組成】

【自備試劑】樣品 RNA，超純水。

【樣本要求】

1. 新鮮采集的咽/拭子、鼻/拭子標(biāo)本，并使用滅菌生理鹽水懸浮。

2. 患病動(dòng)物的腦、心、肝、脾、肺、腎、扁桃體等病理組織。

3. 標(biāo)本收集后若不能立即檢測(cè)，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長(zhǎng)期保存，標(biāo)本應(yīng)凍存于-20℃～-80℃。

4. 標(biāo)本保存期間應(yīng)避免反復(fù)凍融。

【注意事項(xiàng)】

一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E1-10E6 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能

污染樣品或本試劑盒的其他成分。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本  產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對(duì)照。1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 6，5，4，3，2，1。

2.    用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同。

3.    在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4.    換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5.    換槍頭，在 4 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E4 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6.    重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 RNA 的制備

7.    如果有 N 個(gè)樣品，最好設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的是 PC（樣品制備陽性對(duì)照）和 NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢匀￡栃詫?duì)照的 1000 倍稀釋液10μL 再加上一定量的水，使總體積與待提取樣品的規(guī)定體積一致，以此作為 PC。另外用水作為 NC。

8.    用自選方法純化樣品的 RNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑盒兼容。

三、Probe qRT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9.    如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) RT-PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 RT-PCR 陰性對(duì)照（用水做模板）， 6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè)RT-PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 RT-PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），1 個(gè)用于 RT-PCR 陽性對(duì)照（用第 4 號(hào)管的陽性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10.    在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)  置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好  后最后加）：

11.  蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 RT-PCR：

五、數(shù)據(jù)處理

12.  如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

13.  如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 36。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 36 則為陽性。如果在 36-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct

值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。