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產(chǎn)品簡(jiǎn)介
熒光定量RT-PCR試劑盒（兩步法）是整合 cDNA 第一鏈合成試劑（RT 試劑盒）和即用型 qPCR 試劑而得的qRT-PCR 試劑盒。cDNA 第一鏈合成反應(yīng)和 qPCR 反應(yīng)分別在兩個(gè)離心管中進(jìn)行。
產(chǎn)品分類
中文名稱：熒光定量RT-PCR試劑盒（兩步法）
英文名稱：Two-Step qRT-PCR Kit
規(guī)格及成分
成 分 | 十孔盒包裝 |
2×RT Mix | 40 uL（黃蓋） |
MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 (含 RI) | 10 uL（紅蓋） |
2×qPCR MagicMix | 1 mL（棕色管） |
定量PCR 專用模板稀釋液 | 1 mL（綠蓋） |
RNase-free 水 | 1 mL（藍(lán)蓋） |
使用手冊(cè) | 1 份 |
熒光定量RT-PCR試劑盒（兩步法）低溫運(yùn)輸,-20℃保存, 有效期一年。
自備試劑
樣品 RNA、PCR 引物、ROX 染料
熒光定量 RT-PCR 試劑盒（兩步法） 特點(diǎn)：
1. 即開即用，足夠 50 次 RT 反應(yīng)（10uL 體系）和 50 次 qPCR 反應(yīng)（20 uL 體系）。
2. RT 和 PCR 分開進(jìn)行，方便優(yōu)化 RT 和 qPCR 條件，也方便一個(gè) RT 反應(yīng)用于多個(gè)不同引物的 qPCR 擴(kuò)增。
3. RT mix 中含除酶、模板和引物以外的 RT 成分，簡(jiǎn)化了反應(yīng)設(shè)置步驟。
4. qPCR mix 是 2×預(yù)配液，也簡(jiǎn)化了反應(yīng)設(shè)置步驟。
5. qPCR mix 含 qPCR 染料，無(wú)需另外加入相關(guān)熒光 PCR 染料。
6. 擴(kuò)增效率高, 最長(zhǎng)可擴(kuò)增 5 Kbp 以上的 RNA。
7. 提供定量 PCR 專用模板稀釋液，保證在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)低濃度樣品的準(zhǔn)確性。
使用方法
一、樣品 RNA 的制備（本試劑盒不提供相關(guān)試劑）
1、可用自本公司各種 RNA 提取方法提取樣品的 RNA，也可以選用其他供應(yīng)商的產(chǎn)品，但得到的 RNA 一定要溶解在RNase-free 的超純水中。
2、如果需要用 RNA 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，則需在此步用定量 PCR 專用模板稀釋液將 RNA 樣品稀釋不同梯度，并分別作為下步 RT 反應(yīng)的模板。
3、由于污染的 gDNA 會(huì)嚴(yán)重影響 RNA 的定量，因必須che底去除 RNA 樣品中的gDNA 污染。用戶可以另購(gòu) RNase-free DNase 來(lái)消化 RNA 樣品，也可以合成只識(shí)別外顯子的引物。
二：RT（逆轉(zhuǎn)錄）反應(yīng)合成 cDNA
4、按下表配制 RT 反應(yīng)體系（10 uL 體系），在每個(gè)管中加入下列成分:
| 成分 | 加入量 |
總 RNA | 100-500 ng |
2×RT mix | 4 uL |
MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 | 1 uL |
RNase-free 水 | 補(bǔ)到 10 uL |
5、42℃保溫 60 分鐘。此步為 RT 反應(yīng)。
6、85℃保溫 5 秒以終止反應(yīng)，然后放置在冰上待用。
7、合成的 cDNA 可以直接作為下步 qPCR 模板使用，不需要純化。剩余樣品可以放置在
-20℃長(zhǎng)期保存。如果需要用 cDNA 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，則需在此步用定量 PCR 專用模板稀釋液將 cDNA 樣品稀釋不同梯度，并分別作為下步qPCR 反應(yīng)的模板。
三、qPCR（20 uL 體系）
8、在每個(gè) PCR 管中加入下列成分：
成分 | 加入量 |
qPCR MagicMix | 10 uL |
cDNA 樣品（來(lái)于上步的 RT 反應(yīng)） | 2 uL |
PCR 正向引物(10 pmol/uL) | 1 uL |
PCR 反向引物(10 pmol/uL) | 1 uL |
自備 ROX 染料I 或II（見注） | 2 uL |
RNase-free 水 | 4 uL |
注意：如果使用 ABI 公司的 7500，7700 和 7900 三種型號(hào)的熒光 PCR 儀器，則需用自備的 ROX 進(jìn)行 Ct 值校正。對(duì) ABI 7700 和 7900，ROX 的最佳濃度為 1×（即在每 20 uL 反應(yīng)體系中加 2 uL 10×ROX）。對(duì) ABI 7500， ROX 的最佳濃度為 0.05-0.1×（每 20 uL 反應(yīng)體系加 0.1-0.2 uL 10×ROX；也可將 10×ROX 稀釋到
1×，然后每個(gè)反應(yīng)體系加入 1-2 uL 1×ROX）。ROX 會(huì)在溶解曲線中產(chǎn)生噪音，因此，如果出現(xiàn)了雜峰，將軟件中“Passive Reference Dye"中的“ROX"選項(xiàng)取消打勾，然后重新分析數(shù)據(jù)。
對(duì)于iCycler IQ，MJ Opticon，MJ Chromo4，MX3000，MX4000, RotorGene3000， RotorGene 6000 和 LightCycler 480 等型號(hào)的熒光PCR 儀器，ROX 不是必須的但加入的話也不會(huì)影響整個(gè) PCR 分析。
9、PCR 反應(yīng)參數(shù)(需要用戶根據(jù)模板和引物決定，下面參數(shù)的只做參考)：
過(guò)程 | 溫度 | 時(shí)間 |
預(yù)變性 | 94℃ | 5 min |
PCR 反應(yīng) （40 個(gè)循環(huán)） | 94℃ | 1 min |
55℃ | 1 min | |
72℃ | 2 min | |
最后延伸 | 72℃ | 10 min |
10、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和溶解曲線，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體方法
隨儀器不同而不同，請(qǐng)參考 qPCR 儀器手冊(cè)。
關(guān)聯(lián)產(chǎn)品
雙酶一管式 RT-PCR 試劑盒
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