優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司 · 品質(zhì)創(chuàng)造價(jià)值 服務(wù)成就未來(lái)！
服務(wù)熱線：15021281375
服務(wù)熱線：15021281375
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
免RNA提取RT-PCR試劑盒是一種免 RNA 提取的 RT-PCR 試劑盒，它使用精心優(yōu)化的細(xì)胞裂解液直接裂解培養(yǎng)細(xì)胞，然后直接在細(xì)胞裂解液中進(jìn)行 RT，再用 cDNA 進(jìn)行 PCR 或熒光定量 PCR。
產(chǎn)品分類
中文名稱：免RNA提取RT-PCR試劑盒
英文名稱：Cell Lysate RT-PCR Kit
運(yùn)輸及保存
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期兩年
自備試劑
RT 引物、PCR 引物對(duì)
規(guī)格及成分
成 分 | 十孔盒包裝 |
溶液 A | 25 mL |
溶液 B | 0.5 mL |
MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 (含 RI) | 100 µL |
RT Buffer（含 dNTP） | 300 µL |
PCR MagicMix 3.0(含染料) | 9 mL |
RNase-free 水 | 10 mL |
使用手冊(cè) | 1 份 |
使用方法
注意：無(wú) RNase 的環(huán)境和使用無(wú) RNase 污染的試劑是本實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。
強(qiáng)烈建議使用優(yōu)利科的固相 RNase 清除劑去除工作臺(tái)面的 RNase，用氣相
RNase 去除空氣中的 RNase。實(shí)驗(yàn)前需要將 95%乙醇放-70℃預(yù)冷，最好用空槍頭盒盛乙醇。
一、細(xì)胞培養(yǎng)、裂解
1. 按常規(guī)方法培養(yǎng)細(xì)胞、胰/酶消化并計(jì)數(shù)。
2. 轉(zhuǎn)移 1×10E5 個(gè)細(xì)胞到離心管中，400×g 離心 4 分鐘。
3. 吸棄上清（即培養(yǎng)基），保留細(xì)胞沉淀。
4. 用 0.5 mL 溶液 A 重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞濃度調(diào)整到 2×10E5 細(xì)胞/mL。
5. 轉(zhuǎn)移 10 µL 的懸浮細(xì)胞到 0.2 mL PCR 管中，并加入 10 µL 的溶液 B，此時(shí)細(xì)胞終濃度為 10E5 細(xì)胞/mL。
6. 迅速將離心管插入浮子中，放入-70℃預(yù)冷的、95%乙醇中 1-3 分鐘。10 µL 槍頭盒一般能讓 0.2 mL 的 PCR 管一半沒(méi)入到乙醇中。
7. 在室溫的水浴鍋中快速解凍細(xì)胞，渦旋 10 秒后短暫離心數(shù)秒，將管中液體
（細(xì)胞裂解液）轉(zhuǎn)移到新的離心管中，放冰上待用。
二、RT（逆轉(zhuǎn)錄）反應(yīng)合成 cDNA
8. 按下表設(shè)置 RT 反應(yīng)體系（以 20 µL 體系為例）:
成分 | 樣品管 | 陰性對(duì)照管 |
細(xì)胞裂解液（含 RNA） | 2.5 µL | 2.5 µL |
RT Buffer（含 dNTP） | 6 µL | 6 µL |
MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（含 RI） | 2 µL | 無(wú) |
RT 引物(100ng/µL) | 1 µL | 1 µL |
RNase-free 水 | 補(bǔ)水到 20 µL | 補(bǔ)水到 20 µL |
9 . 2℃保溫 60 分鐘。此步為 RT 反應(yīng)。
10. 70℃保溫 10 分鐘以終止反應(yīng)，然后放冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作為 PCR 模板使用，不需要純化。也可以放置在-20℃長(zhǎng)期保存
三、PCR 方案一（RT 產(chǎn)物全部用于 PCR）
11. 在上步的 RT 反應(yīng)管中直接按下表加入各成分（以 100 µL 體系為例）：
成分 | 每管加入量 |
PCR MagicMix 3.0（已加染料） | 50 µL |
自備正向 PCR 引物 (100 ng/µL) | 2 µL |
RNase-free 水 | 補(bǔ)水到 100 µL |
12. 直接進(jìn)入第 14 步。
四、PCR 方案二（部分 RT 產(chǎn)物用于 PCR）
13. 按下表設(shè)置 PCR 反應(yīng)體系（以 30 µL 體系為例）：
成分 | 每管加入量 |
PCR MagicMix 3.0（已加染料） | 15 µL |
cDNA 樣品（RT 反應(yīng)產(chǎn)物） | 1-5 µL |
自備正向 PCR 引物 (100 ng/µL) | 1 µL |
自備反向 PCR 引物 (100 ng/µL) | 1 µL |
RNase-free 水 | 補(bǔ)水到 30 µL |
注意：RT 引物可以用做反向 PCR 引物。
14. PCR 反應(yīng)參數(shù)(需要根據(jù)模板和引物 Tm 值決定，下面的參數(shù)只做參考)：
過(guò)程 | 溫度 | 時(shí)間 |
預(yù)變性 | 94℃ | 5 min |
PCR 反應(yīng) （35 個(gè)循環(huán)） | 94℃ | 1 min |
55℃ | 1 min | |
72℃ | 2 min | |
最后延伸 | 72℃ | 10 min |
五、電泳檢測(cè)
15. 取 5-10 µL PCR 產(chǎn)物直接在瓊脂糖凝膠上電泳，跟分子量標(biāo)準(zhǔn)比較估計(jì)出擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。注：本試劑盒中的 PCR mix 含有甘油和染料，可以直接上樣，不需要額外再加電泳上樣液。
免RNA提取RT-PCR試劑盒
特點(diǎn)如下：
1. 免 RNA 提取，從細(xì)胞裂解到 RT-PCR 或?qū)崟r(shí)定量 RT-PCR 結(jié)果只需三個(gè)步驟，省略了整個(gè) RNA 提取過(guò)程。
2. 靈敏度不低于常規(guī)方法（先提總 RNA 再進(jìn)行 RT-PCR），不但可以檢測(cè)到低拷貝的 RNA，還可用于檢測(cè) miRNA。
3. 整合了去除基因組 DNA 的步驟，只檢測(cè) RNA，無(wú)需擔(dān)心基因組 DNA 的污染。
4. 每次只需要 10-100000 個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞或含相應(yīng)細(xì)胞數(shù)的痕量組織（如 LCM 樣品），驗(yàn)證過(guò)的細(xì)胞包括 Hela、CHO、293、COS-7 等，但不能用于 U937 細(xì)胞系。
5. 兩步法 RT-PCR，后續(xù)使用靈活。得到的 cDNA 既可用于普通 PCR，也可用于基于 SYBR 的熒光定量 PCR，也可用于其他定量 PCR（如 TaqMan）， 非常靈活。
6. 即適用于少量樣品，也適用于平行處理大量樣品及高通量篩查。
7. 本產(chǎn)品足夠用于 50 次 20µL 體系的 RT 和 600 次 30µL 體系（或約 200 次100µL 體系）的 PCR。
掃碼加微信 移動(dòng)端瀏覽
當(dāng)前位置：
相關(guān)文章
上一個(gè)：
返回列表
